Методы генетики. Медицинская биология Цитогенетический метод используется для определения

Клиническая генетика. Е.Ф. Давыденкова, И.С. Либерман. Ленинград. «Медицина». 1976 год.

ВЕДУЩИЕ СПЕЦИАЛИСТЫ В ОБЛАСТИ ГЕНЕТИКИ

Амелина Светлана Сергеевна - профессор кафедры по курсу генетики и лабораторной генетики, доктор медицинских наук. Врач генетик высшей квалификационной категории

Дегтерева Елена Валентиновна - ассистент кафедры по курсу генетики и лабораторной генетики, врач-генетик первой категории

Редактор страницы: Крючкова Оксана Александровна

К цитогенетическим методам, применяемым в клинике, относятся определение полового хроматина (X- и У-хроматина) в интерфазных ядрах различных тканей, морфологических особен­ностей хроматина в нейтрофилах периферической крови (бара­банные палочки), а также исследование хромосом на стадии метафазы митоза для определения кариотипа.

Исследование полового хроматина

В 1949 г. Ваrr и Bertram описали в интерфазных ядрах компактное скопление хроматина в виде темноокрашенного тельца, получившее название полового хроматина (sex chromatin). В норме он встречается у женщин, у мужчин он отсутствует или представ­лен в незначительном количестве. У мужчин, имеющих одну Х-хромосому, она всегда активна, у женщин активной является только одна из двух Х-хромосом, вторая находится в неактивном, спирализованном состоянии. Она образует тельце полового хро­матина, которое определяется в интерфазном ядре клетки женского организма. Был разработан простой и быстрый метод определения Х-хроматина в мазках слизистой полости рта с окраской препа­ратов ацетоорсеином. Быстрота и легкость выполнения привели к широкому применению этого метода в медицинской практике.

Метод, до настоящего времени имевшийся в нашем распоряже­нии, выявлял только Х-хроматин, т. е. хроматин, образованный инактивированной Х-хромосомой. С момента опубликования иссле­дований Caspersson с соавт. (1969, 1970) появились возможности определения У-хроматина при помощи люминесцентно-микроско­пического исследования. Работами Zech (1969) было показано, что часть длинного плеча У-хромосомы флюоресцирует при окраши­вании акрихин-ипритом. Затем Pearson с сотр. (1970) обнаружили, что в интерфазном ядре клеток мужчин имеется флюоресцирующее тельце, названное ими F-тельцем, которое у мужчин с кариотипом ХУУ имеется в двойном количестве. Таким образом, появился

простой метод определения У-хроматина в буквальных соскобах, который может быть применен для клинических целей. Это очень удобно для популяционных исследований, так как полное карио- типирование является сложным и трудоемким.

Таким образом, в настоящее время необходимо дифференци­ровать X-хроматин и У-хроматин.

Исследование Х-хроматина. Х-хроматин может быть определен в различных тканях организма: в клетках кожи, слизистой оболочки рта, уретры, влагалища, в клетках крови, в клетках волосяной луковицы, в эпителиальных клетках осадка мочи, в амниотической жидкости и др. Он может быть исследован и в посмертном материале, например в клетках почечных канальцев мертворожденных детей (Н_ П. Бочков и сотр., 1966).

Наиболее распространенным является определение полового хроматина в буккальных мазках по методу Sanderson и Stewart (1961) с одномоментной фиксацией и окраской препаратов ацетоорсеином.

Соскоб берется металлическим шпателем с внутренней поверх­ности щеки, наносится равномерным слоем на предметное стекло, окрашивается одной каплей 1,5% или 2% раствора уксуснокислого ацетоорсеина. Раствор красителя готовится следующим образом: в 45 мл ледяной уксусной кислоты растворяется 1,5-2 г орсеина; раствор нагревается до появления паров, добавляется 55 мл дистиллированной воды и после охлаждения фильтруется. Затем препарат накрывается покровным стеклом, на которое произво­дится легкое надавливание через сложенную в 3-4 слоя марлю или фильтровальную бумагу для удаления лишней краски. На приготовление препарата требуется 2-3 мин. Если препараты просматриваются не сразу, то края покровного стекла покрыва­ются парафином для предупреждения от высыхания. В таком виде препараты можно сохранять в холодильнике до 2 суток.

Ацетоорсеин окрашивает Х-хроматин в темно-фиолетовый цвет, а нуклеоплазму - в бледно-розовый.

Для более контрастного окрашивания Х-хроматина или при отсутствии ацетоорсеина в нашей лаборатории с успехом приме­няется метод окраски, разработанный сотрудником нашей лабо­ратории- А. М. Захаровым. Он основан на метахроматическом окрашивании гетерохроматина красителями тиозиновой группы: метиленовый синий, азур I. Эти красители отечественного про­изводства обычно имеются в достаточном количестве в любой лаборатории.

Применяется 0,2-0,5% раствор одного из вышеуказанных красителей в дистиллированной воде. Разведение проводится из расчета 20-50 мг красителя на 10 мл Н20. Для приготовления одного препарата требуется 2-3 капли раствора. Требуется довести раствор до pH 4,3-4,7 несколькими каплями фосфатного буфера. Употребление буфера не всегда обязательно, так как при растворении краситель сам снижает значение pH до нужной ве­личины. Приготовление препаратов проводится таким же образом, как при ацетоорсеиновом методе.

В отличие от орсеинового метода окрашивание производится без одновременной фиксации кислотой, что предотвращает сморщивание части клеток, поэтому количество Х-хроматина при подсчете превышает в среднем на 5% то количество, которое получается при ацетоорсеиновом методе. При этом методе окрашивания цитоплазма клеток эпителия бесцветна, ядра приобретают бледно-фиолетовый цвет, тельце полового хроматина окрашивается более интенсивно и имеет красноватый цвет.

Для подсчета полового хроматина используются микроскопы МБИ- 3 или МБИ-6 с иммерсионными объективами. Подсчитывается не менее 100 пригодных для анализа ядер, при этом учитываются ядра с ровным контуром, гладкой оболочкой и половым хроматином, прилегающим к ядерной оболочке. Просматривается обычно несколько полей зрения в разных местах препарата.

По количеству телец Х-хроматина можно судить о количестве Х-хромосом. Число Х-хромосом всегда на единицу больше числа телец полового хроматина.

В последние годы получило распространение определение полового хроматина в клетках опухолей. Обнаруживается несоответствие между полом больного и «клеточным полом» опухоли. Выявляется также зависимость между содержанием полового хроматина и чувствительностью опухоли к гормонотерапии.

Исследование У-хроматина. Определение У-хроматина в ядрах клеток на стадии интерфазы может быть осуществлено при применении флюорохромных красителей, таких как акрихин или акрихин-иприт с последующей люминесцентной микроскопией. Таким образом могут быть идентифицированы хромосомы на стадии метафазы митоза, а, также хроматин в ядрах клеток. Акрихин-иприт окрашивает дистальные участки длинных плеч У-хромосомы в метафазе. Кроме того, маленькие округлые флюоресцирующие
тельца наблюдаются в интерфазных ядрах. Они встречаются у лиц мужского пола и могут рассматриваться как У-хроматин. При хромосомных нарушениях типа ХУУ наблюдается два тельца У-хроматина (рис 5). Большие популяционные исследования показали, что наиболее удобными для выявления У-хроматина

Рис. 5. Два флюоресцирующих тельца У-хроматина в интерфазном ядре больного с синдромом 47, XYY.
Окраска акрихин-ипритом.

являются эпителиальные клетки слизистой щеки и лимфоциты периферической крови (Pearson и сотр., 1970; I’olani и Multon, 1971; Robinson, 1971).

Сейчас усиленно изучаются особенности F-хроматина в норме и патологии, вариации в связи с возрастом, различным состоянием организма, корреляцией с размером флюоресцентной части метафазной У-хромосомы и др.

Соскоб эпителия слизистой щеки, полученный при помощи шпателя, наносится ровным слоем на покровное или предметное стекло. Высушенные мазки фиксируют в абсолютном метиловом спирте в течение 2 мин, а затем проводят через нисходящий ряд спиртов (этиловый спирт), выдерживая по 30 с в каждом, до воды. Мазок помещают в буфер Мак-Илвейна (pH 7,0) на 8 мин при 8°. Мазки окрашивают в течение 8-10 мин в 0,005% растворе акри­хин-иприта. Затем препараты споласкивают в свежей водопро­водной воде и дифференцируют в двух-трех порциях цитратно- фосфатного буфера Мак-Илвейна по 1-2 мин и заключают в смесь вода-глицерин (1: 1). Излишки среды тщательно удаляют фильтровальной бумагой и края покровного стекла заливают парафином.

Препараты анализируют под люминесцентным микроскопом (МЛ-2 или МЛ-3, лампа ДРШ 250 с фильтром ФС-2 и СС-2 и барьер­ным фильтром ЖС 18 + ЖЗС 19).

В ядрах клеток буквального эпителия У-хроматин обнаружи­вается в виде ярко светящихся телец на фоне умеренного свече­ния остального хроматина ядра. Общее количество клеток с У-хроматином колеблется от 33 до 92%. Размер одиночного тельца У-хроматина около 0,25-0,8 мкм в диаметре. Но У-хроматин может быть представлен в виде одной, двух, трех и более мелких глыбок в ядре. Интерфазный У-хроматин коррелируется с вариа­циями в размерах флюоресцирующих участков У-хромосом в метафазных пластинках.

Исследование У-хроматина люминесцентно-микроскопическим методом в комплексе с методом определения Х-хроматина дает возможность выявлять набор половых хромосом без кариотипирования. Исследование эндоцервикальных мазков с помощью флюоресцентной методики можно использовать для пренатального определения пола.

В генетике человека используются разнообразные методы иссле­дования, применяемые и в других разделах биологии - генетике, физиологии, цитологии, биохимии и др. Антропогенетика располагает также собственными методами исследования: цитогенетическим, близнецовым, генеалогическим и др. 4

Достижениями молекулярной биологии и биохимии внесен боль­шой вклад в развитие генетики. В настоящее время биохимическим и молекулярно-генетическим методам исследования принадлежит веду­щая роль в генетике человека и медицинской генетике. Однако и клас­сические методы генетики человека, такие как цитогенетический, генеалогический и близнецовый, имеют существенное значение в на­стоящее время, особенно в вопросах диагностики, медико-генетического консультирования и прогнозирования потомства.

Ознакомимся с возможностями цитогенетического метода.

Суть этого метода заключается в изучении строения отдельных хромосом, а также особенностей набора хромосом клеток человека в норме и патологии. Удобным объектом для этого служат лимфоциты, клетки эпителия щеки и другие клетки, которые легко получать, культивировать и подвергать кариологическому анализу. Это важный метод определения пола и хромосомных наследственных заболеваний человека.

Основой цитогенетического метода является изучение морфологии отдельных хромосом клеток человека. Современный этап познания строения хромосом характеризуется созданием молекулярных моделей этих важнейших структур ядра, изучением роли отдельных компо­нентов хромосом в хранении и передаче наследственной инфор­мации.

В главе 1 мы рассмотрели такие компоненты хромосом, как белки и нуклеиновые кислоты. Здесь же кратко остановимся на строении и морфологии хромосом.

Строение хромосом.

Хромосомную теорию наследственности создал американский уче­ный Т. Г. Морган. Проведя большое количество исследований на плодовой мушке дрозофиле, Морган и его ученики установили, что именно в хромосомах находятся открытые Менделем факторы наследственности, которые были названы генами. Т. Морган и его ученики показали, что гены расположены линейно по длине хромо­сомы.

После того как было доказано, что хромосомы являются осно­вными генофорами (носителями генов), начался период их наибо­лее интенсивного изучения. Успехи молекулярной биологии и генетики позволили понять некоторые закономерности строения и функциониро­вания хромосом прокариот и эукариот, однако многое здесь остается еще неизвестным. В последние годы хромосомы эукариот, особенно человека, становятся предметом изучения различных специалистов, начиная от генетиков и кончая физиками.

Внастоящее время установлено, что в основе строения хромосомы лежит хроматин - сложный комплекс ДНК, белков, РНК и других веществ, входящих в хромосому (строение хроматина мы подробно рассмотрели в главе 1). Предполагается, что в хромосому человека входит одна гигантская молекула ДНК, молекулы РНК, гистоны и кислые белки, различные ферменты, фосфолипиды, металлы Са 2+ , Mg 2+ и некоторые другие вещества. Способ укладки и взаимного расположения молекул этих химических соединений в хромосоме пока не известен. Длинная нить ДНК не может располагаться в хромосоме беспорядочно. Существует предположение, что нить ДНК упакована закономерным образом и связана с белками.

Ф. Арриги и соавторы (1971) установили, что уникальные последо­вательности занимают более 56% ДНК хромосом человека, высокопов­торяющиеся - 12,4 %, промежуточные повторы - 8 %. Общее количество повторяющихся генов в ДНК хромосомы человека равно 28%. Число хромосом у человека длительное время оставалось невыяснен­ным. Дело в том, что опреде­лить количество хромосом у млекопитающих, особенно у человека, было трудно. Хромо­сомы оказались маленькими, весьма многочисленными, пло­хо поддавались подсчету. При фиксации клетки они слива­лись в комки, что затрудняло определение истинного числа хромосом. Поэтому первые исследователи не могли точно и правильно подсчитать коли­чество хромосом в клетках человека. Называлось разное количество хромосом - от 44 до 50.

О
бычно хромосомы в клетках наблюдают во время митоза на ста­дии метафазной пластинки. В интерфазном ядре хромосомы в световой микроскоп не видны. В 1912 г. Г. Винивартер, изучая хромосомы в сперматогониях и оогониях половых желез человека, удаленных во время операции, установил, что мужской набор хромосом (кариотип) содержит 47 хромосом, а женский - 48. В 1922 г. Т. Пайнтер повторил исследования Винивартера и установил, что мужской и женский кариотипы содержат по 48 хромосом, но женский отличается от мужского только двумя хромосомами. У женщин находится 2 большие половые хромосомы, а у мужчины одна большая Х-хромосома и одна маленькая К-хромосома. В последующие годы эту точку зрения под­держивали и другие ученые. П. И. Живаго и А. Г. Андреа (1932) предложили первую классификацию хромосом в зависимости от их длины. Так как хромосомы очень близко располагаются одна около другой и их очень трудно исследовать, то и в последующие го­ды точное число хромосом у человека служило предметом споров и дискуссий. Однако постепенно было достигнуто согласие между исследователями по этому вопросу, и в течение 30 лет большинство цитогенетиков считало, что у человека диплоидное число хромосом равно 48, а гаплоидное - 24. Усовершенствованные методы изучения хро­мосом позволили получить более точные сведения о количестве хромо­сом в клетках у человека, а также выявить аномалии нормального кариотипа, ответственные за некоторые уродства. Особенно плодотвор­ным оказались два метода:

1. Обработка культуры клеток алкалоидом колхицином, который ведет к накоплению делящихся клеток на стадии метафазы;

2. Обработка клеток слабыми растворами солей, вызывающими набухание, расправление хромосом, что облегчает их исследование.

В 1956 г. шведские цитологи Дж. Тийо и А. Леван изготовили культуры клеток из тканей легких, взятых у абортированных челове­ческих эмбрионов и, используя усовершенствованную методику обра­ботки клеток, получили необычайно четкие препараты, в которых ясно было видно 46 хромосом. 5

Несколькими месяцами позднее Ч. Форд и Дж. Хаммертон в Англии установили, что диплоидные предшественники половых клеток в се­менниках мужчин (сперматогонии) также имеют по 46 хромосом, а гаплоидные (сперматоциты 1-го деления) - по 23 хромосомы.

После этого были изучены многие клетки из разных органов и тканей человека и везде нормальное число хромосом оказалось равным 46.

Женский кариотип отличается от мужского только одной половой хромосомой. Остальные 22 пары одинаковы у мужчин и женщин. Эти 22 пары хромосом называются аутосомами. Нормальный кариотип состоит из 44 аутосом (22 пары) и двух половых хромосом - XX у женщин и XY у мужчин, т. е. женский кариотип имеет две большие половые хромосомы, а мужской - одну большую и одну малень­кую.

В половых клетках человека находится одинарный (гаплоидный) набор хромосом - 23, а в соматических клетках - двойной (диплоидный) набор - 46. Эти открытия стимулировали дальнейшее изу­чение хромосом. Были разработаны методы исследования хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови и на других объектах. В настоящее время хромосомы относительно легко исследуют в лим­фоцитах периферической крови. Венозную кровь помещают в специ­альную питательную среду, добавляют фитогемаглютинин, который стимулирует клетки к делению, и помещают на 72 ч. в термостат. За 6 ч. до конца инкубации сюда добавляют колхицин, который за­держивает процесс деления клеток на стадии метафазной пластинки. Затем культуру помещают в гипотонический раствор NaCl, в котором клетки набухают, что приводит к легкому разрыву оболочек ядра и переходу хромосом в цитоплазму. После этого препараты окрашивают ядерными красителями, в частности ацетоорсеином, и рассматривают их в световом микроскопе с иммерсией.

Под микроскопом учитывают общее количество хромосом, фото­графируют их, затем из фото вырезают ножницами каждую хромосому и наклеивают на чистый лист бумаги в ряд, начиная от самой боль­шой (первой) хромосомы и кончая самой маленькой (двадцать второй) и половой Y-хромосомой. Люминесцентная методика позволяет быстро и просто проводить массовые исследования с целью выявления боль­ных с различными типами хромосомных аномалий. Совокупность коли­чественных (число хромосом и их размеры) и качественных (морфо­логия хромосом) признаков диплоидного набора единичной клетки обозначается термином «кариотип». Строение хромосом изменяется в зависимости от стадии деления клеток (профазы, метафазы, анафазы, телофазы).

Уже в профазе митоза видно, что хромосома образована двумя взаимно переплетающимися нитями одинакового диаметра - хроматидами. В метафазе хромосома уже спирализована, и две ее хроматиды ложатся параллельно, разделенные узкой щелью. Каждая хроматида состоит из двух полухроматид. В результате митоза хроматиды мате­ринской хромосомы становятся сестринскими хромосомами, а полухроматиды - их хроматидами. В основе хроматид лежат хромонемы - так называют более тонкие нити ДНП, состоящие из белка и нуклеи­новых кислот.

В интерфазе (промежуток между двумя делениями клеток) хрома­тин тесно связан с ядерными мембранами и ядерным белковым матриксом. Он образует также большие участки деспирализованных ни­тей ДНП. Затем постепенно хроматин спирализуется, образуя типич­ные метафазные х
ромосомы. Размеры их варьируют от 2 до 10 микрон.

В настоящее время интенсивно исследуются структурные особен­ности аутосом и половых хромосом (на клетках костного мозга, лимфоцитах, фибробластах, клетках кожи, регенерирующей печени).

Вхромосомах выявлены структуры, названные хромомерами. Хромомер - это спирализованный участок хромонемы. Промежутки меж­ду хромомерами представлены хромонемными нитями. Расположение хромомеров на каждой хромосоме строго фиксировано, наследственно детерминировано.

Хромомер - сравнительно крупная генетическая единица, сравни­мая по длине с хромосомой кишечной палочки. Строение и функция хромомера - основная загадка современной генетики. Предполагают, что некоторые хромомеры - это один генетический локус, где есть один структурный ген и много генов регуляторных. Возможно, в дру­гих хромомерах располагается несколько структурных генов.

Хромонемы и хромомеры окружены неокрашивающимся вещест­вом - матриксом. Полагают, что матрикс содержит дезоксирибонуклеиновую и рибонуклеиновую кислоты, белки.

Определенные участки хромосом образуют ядрышки. Ядрышки - это более или менее деспирализованные участки хромосом, окружен­ные продуктами деятельности генов (рибосомы, частицы РНК и т. п.). Здесь идет синтез рибосомальной РНК, а также осуществляются определенные этапы формирования рибосом. В нем синтезируется боль­шая часть РНК клетки.

В метафазной хромосоме различают еще несколько образований: центромеру, два плеча хромосомы, теломеры и спутник.

Центромерный (meros - по-гречески, часть) участок хромосомы - это неокрашивающийся разрыв в хромосоме, видимый на препарате хромосом. Центромера содержит 2-3 пары хромомер, имеет сложное строение. Предполагают, что она направляет движение хро­мосомы в митозе. К центромерам прикрепляются нити веретена.

Теломеры - специальные структуры на концах хромосом - также имеют сложное строение. В их состав входит несколько хромомер. Теломеры предотвращают концевое присоединение метафазных хромо­сом друг к другу. Отсутствие теломеров делает хромосому «липкой» - она легко присоединяется к другим фрагментам хромосом.

Одни участки хромосомы называются эухроматиновыми, другие - гетерохроматиновыми. Эухроматиновые районы хромосом - это гене­тически активные участки, они содержат основной комплекс функ­ционирующих генов ядер. Потеря даже мельчайшего фрагмента эухроматина может вызвать гибель организма. Гетерохроматиновые районы хромосом - обычно сильно спирализованы и, как правило, генети­чески мало активны. В гетерохроматине находится ядрышковый ор­ганизатор. Потеря даже значительной части гетерохроматина часто не приводит организм к гибели. Гетерохроматиновые участки хромосомы реплицируются позднее, чем эухроматиновые. Следует помнить, что эухроматин и гетерохроматин - это не вещество, а функциональ­ное состояние хромосомы.

Если расположить фотографии гомологичных хромосом по мере возрастания их размеров, то можно получить так называемую идиограмму кариотипа. Таким образом, идиограмма - это графическое изображение хромосом. На идиограмме пары гомологов располагаются рядами в порядке убывающего размера.

У человека на идиограмме среди 46 хромосом различают три типа хромосом в зависимости от положения в хромосоме центромер:

1. Метацентрические - центромера занимает центральное поло­жение в хромосоме, оба плеча хромосомы имеют почти одинаковую длину;

2. Субметацентрические - центромера располагается ближе к одному концу хромосомы, в результате чего плечи хромосомы разной длины.

3. Акроцентрические - центромера находится у конца хромосо­мы. Одно плечо очень короткое, другое длинное. Хромосомы не очень легко отличать одну от другой. Цитогенетики с целью унификации методов идентификации хромосом на конференции в 1960 г. в г. Ден­вере (США) предложили классификацию, учитывающую величину хромосом и расположения центромер. Патау в том же году дополнил эту классификацию и предложил разделить хромосомы на 7 групп. Согласно этой классификации, к первой группе А относятся крупные 1, 2 и 3 суб- и акроцентрические хромосомы. Ко второй группе В - крупные Субметацентрические пары 4-5. К третьей группе С относят­ся средние субакроцентрические (6-12 пары) и Х-хромосома, которая по величине находится между 6 и 7 хромосомами. К группе Д (чет­вертой) относятся средние акроцентрические хромосомы (13, 14 и 15 пары). К группе Е (пятой)- мелкие Субметацентрические хромосомы (16, 17 и 18 пары). К группе F (шестой) мелкие метацентрические (19 и 20 пары), а к группе G (седьмой) - самые мелкие акроцентрические хромосомы (21 и 22 пары) и мелкая акроцентрическая половая Y-хромосома (табл. 4).

Существуют и другие классификации хромосом (Лондонская, Па­рижская, Чикагская), в которых развиты, конкретизированы и до­полнены положения Денверской классификации, что в конечном итоге облегчает идентификацию и обозначение каждой из хромосом человека и их частей.

Акроцентрические хромосомы IV группы (Д, 13-15 пары) и груп­пы VII (G, 21-22 пары) на коротком плече несут маленькие дополнительные структуры, так называемые сателлиты. В некото­рых случаях эти сателлиты являются причиной сцепления хромосом между собой при делении клеток в мейозе, вследствие чего происходит неравномерное распреде­ление хромосом. В одной половой клетке оказывается 22 хромосомы, а в другой - 24. Так возникают моносомии и трисомии по той или иной паре хро­мосом. Фрагмент одной хромосомы мо­жет присоединиться к хромосоме дру­гой группы (например, фрагмент 21 или 22 присоединяется к 13 или 15). Так возникает транслокация. Трисомия 21-й хромосомы или транслокация ее фраг­мента являются причиной болезни Дауна.

Внутри семи этих групп хромосом на основании лишь внешних различий, видимых в простой микроскоп, провести идентификацию хромосом почти невоз­можно. Но при обработке хромосом акрихини притом и при помощи ряда дру­гих методов окраски их можно иден­тифицировать. Известны различные

способы дифференциальной окраски хромосом по Q-, G-, С-технике (А. Ф.Захаров, 1973) (рис. 27). Назовем некоторые методы идентифи­кации индивидуальных хромосом человека. Широко применяются раз­личные модификации так называемого метода Q. Например, метод QF - с использованием флюорохромов; метод QFQ - с использованием акрихина; метод QFH - с использованием специального красителя фир­мы «Хекст» № 33258, выявляющего повторяющиеся последовательности нуклеотидов в ДНК хромосом (сателлитную ДНК и т. п.). Мощным средством изучения и индивидуальной характеристики хромосом явля­ются модификации трипсинового метода GT. Назовем, например, GTG-метод, включающий обработку хромосом трипсином и окраску краси­телем Гимза, GTL-метод (обработка трипсином и окраска по Лейтману).

Известны методы с обработкой хромосом ацетатными солями и красителем Гимза, методы с использованием гидроокиси бария, акридиноранжа и другие.

ДНК хромосом выявляется при помощи реакции Фельгена, окраски метиловым зеленым, акридиноранжем, красителем № 33258 фирмы «Хекст». Акридиноранжевый краситель с ДНК однонитчатой образует димерные ассоциаты и дает красную люминесценцию, с двунитчатой спиральной ДНК образует одномерные ассоциаты и люминесцирует зеленым светом.

Измеряя интенсивность красной люминесценции, можно судить о количестве свободных мест в ДНП и хроматине, а отношение зеле­ная - красная люминесценция - о функциональной активности хро­мосом.

Гистоны и кислые белки хромосом выявляются при различных рН окраской бромфенодовым синим, зеленым прочным, серебрением, иммунолюминесцентным методом, РНК - окраской галлюцианиновыми квасцами, красителем фирмы «Хекст» № 1, акридиноранжем при нагревании до 60°.

Широко применяются электронная микроскопия, гистоавторадиография и ряд других методов.

В 1969 г. шведский биолог Т. Касперссон и его сотрудники пока­зали, что хромосомы, окрашенные горчичным акрихином и освещенные под микроскопом Наиболее длинноволновой частью ультрафиолетового спектра, начинают люминесцировать, причем одни участки хромосом светятся ярче, другие слабее. Причина этого - разный химический состав поверхности хромосомы. В последующие годы исследователи обнаружили, что концы Y-хромосомы человека светятся ярче любой другой хромосомы человека, поэтому Y-хромосому легко заметить на препарате.

Акрихиниприт преимущественно связывается с ГЦ-парами ДНК. Флюоресцируют отдельные диски гетерохроматиновых участков. Уда­ляют ДНК - свечение исчезает. Составлены карты флюоресцирующих хромосом. Из 27 видов млекопитающих только у человека, шимпанзе, гориллы и орангутанга светятся Y-хромосомы. Свечение связано с повторами генов, которые появились в эволюции 20 млн. лет назад.

Итак, в норме в соматических клетках человека находится 46 хромосом (23 пары), а в половых - 23 хромосомы, по одной хромо­соме каждой пары. При слиянии сперматозоида и яйцеклетки в зиготе количество хромосом удваивается. Таким образом, каждая сомати­ческая клетка организма человека содержит один набор отцовских хромосом и один набор материнских хромосом. Если у человека 46 хромосом, то у различных обезьян число хромосом равно 34, 42, 44, 54, 60, 66.

При действии ультразвука или высокого давления можно добиться разрыва нитей ДНК, которые входят в состав хромосомы, на отдель­ные фрагменты. Подогревая растворы ДНК до температуры 80-100°,

можно вызвать денатурацию ДНК, расхождение двух составляющих ее нитей. При определенных условиях разъединенные нити ДНК могут снова реассоциировать в устойчивую двунитчатую молекулу ДНК (реассоциация или ренатурация ДНК). Денатурацию и ренатурацию ДНК можно получить и на препаратах фиксированных хромосом, обрабатывая их соответствующим образом. Если после этого хромосо­мы окрасить красителем Гимза, то в них выявляется четкая поперечная исчерченность, состоящая из светлых и темных полос. Расположение этих полос в каждой хромосоме разное. Таким образом, по «Гимза-дискам» можно также идентифицировать каждую из 23 пар хро­мосом.

Этими и другими методиками, особенно гибридизацией соматиче­ских клеток различных животных и человека, пользуются для картиро­вания хромосом, т. е. для определения положения разных генов в той или иной хромосоме. В настоящее время в аутосомах и половых хро­мосомах человека картировано около 200 генов.

На конец 1975 г. было локализовано следующее количество генов в различных хромосомах человека (А. Ф. Захаров, 1977): 1 хромосома - 24 гена; 2 хромосомы - 10, 3-2, 4-3, 5-3, 6-14, 7-4, 8-1, 9-8, 10-5, 11-4, 12-10, 13-3, 14-3, 15-6, 16-4, 17-14, 18-1, 19-4, 20-3, 21-4, 22-1; Y-хромосома - 2; Х-хромосома - 95 генов.

Наследственность человека трудно поддается изучению:

Примерно одинаковая продолжительность жизни исследователя (врача) и пациента, максимально может изучит 3-4 поколения в семье,

Поздно наступающая половая зрелость человека и малое число потомков,

Большое число хромосом и генов,

Отсутствие записанных родословных в семье,

Гибридологический метод применять нельзя.

Существует ряд методов, которые позволяют проследить наследование признаков. Это позволяет установить диагноз, бороться с болезнями, провести консультацию лицам, нуждающимся в ней.

Клинико- генеалогический

Биохимический

Цитогенетический

Близнецовый

Популяционно-статестический

Имунно-генетический

Близнецовый метод.

МZ (ОБ) однояйцевые.

1 яйцеклетка + 1 сперматозоид → зигота, которая далее на ранних стадиях делиться на 2 эмбриона.

Всегда одного пола (генетически эдентичны). Различия между ними зависят в основном от действия внешних факторов.

2 яйцеклетка + 2 сперматозоида = → 2 зиготы.

DZ (РБ). Они сходны между собой как 2 сестры или 2 брата, рождённые порознь. Могут быть и разнополые или однополые. Различия зависят от наследственности и от средовых факторов.

Метод позволяет разграничить роль наследственности и среды в разнообразии признаков человека.

Если возникновение признака (или его отсутствие) в значительной степени зависит от генетической конструкции тогда у ОБ совпадение наблюдается чаще.

Внутрипарное сходство близнецов (похожесть) называется конкорданность, у ОБ она > чем РБ.

(псориаз МЗ 61 % РБ 13%) . Шизофрения 69% (10%). Депрессия (психоз) 96% (19%).

90-100% оттенок кожи, форма носа, оттенок радужки, у ОБ

Группа крови, слюны, резусу у ОБ- 100%

81-90% дактилоскоп. Узору у ОБ.

Сущность метода: изучения внутрипарного сходства близнецов, при сравнении которых можно судить о влиянии среды и наследственности на развитие того или иного признака (воздействие хим. в-в, лекарств…).

Цитогенетический метод.

Это микроскопический анализ хромосом (кариотипа) позволяет выявить числовые и структурные изменения хромосом (перестройки, поломки и др..

Хромосомы изучают в делящихся клетках костного мозга, лимфоцитах крови, реже кожи, мышц.

Хромосомы можно изучать и будущего ребёнка (эмбриона): ворсины хориона, клетки плаценты, пуповинной крови, амниотической жидкости (околоплодных вод- метод амниоцентез).

Клетки отбирают, выращивают на питательной среде, добавляют колхитин. Он останавливает митоз на стадии метафазы. Микропрепараты обязательно окрашивают. Существует различные методики цитогенетической диагностики. Методом можно определять половой хроматин (тельце Барра)

Показания к методу:

У пробанда, его родителей или родственников при подозрении на хромосомную болезнь (уточнение диагноза)

При тяжёлых психических расстройствах

При первичной аменореи (отсутствие менструации) бесплодии

При спонтанных абортах, мёртворожденных

У детей с множественными пороками развития, не подходящими под какую либо болезнь.

При изучении мутагенного действия, каких либо факторов (лекарственные средства, наркотики, радиация…)

При проведении медико- генетического консультирования.

Метод приводит к более точной диагностики, к своевременному лечению и предупреждению рождения больного ребёнка.

Цитогенетический метод

Основан на изучении хромосом человека в норме и при патологии. В норме кариотип человека включает 46 хромосом - 22 пары аутосом и две половые хромосомы. Использование данного метода позволило выявить группу болезней, связанных либо с изменением числа хромосом, либо с изменениями их структуры. Такие болезни получили название хромосомных.

Материалом для кариотипического анализа чаще всего являются лимфоциты крови. Кровь берется у взрослых из вены, у новорожденных - из пальца, мочки уха или пятки. Лимфоциты культивируются в особой питательной среде, в состав которой, в частности, добавлены вещества, «заставляющие» лимфоциты интенсивно делиться митозом. Через некоторое время в культуру клеток добавляют колхицин. Колхицин останавливает митоз на уровне метафазы. Именно во время метафазы хромосомы являются наиболее конденсированными. Далее клетки переносятся на предметные стекла, сушатся и окрашиваются различными красителями. Окраска может быть а) рутинной (хромосомы окрашиваются равномерно), б) дифференциальной (хромосомы приобретают поперечную исчерченность, причем каждая хромосома имеет индивидуальный рисунок). Рутинная окраска позволяет выявить геномные мутации, определить групповую принадлежность хромосомы, узнать, в какой группе изменилось число хромосом. Дифференциальная окраска позволяет выявить хромосомные мутации, определить хромосому до номера, выяснить вид хромосомной мутации.

В тех случаях, когда необходимо провести кариотипический анализ плода, для культивирования берутся клетки амниотической (околоплодной) жидкости - смесь фибробластоподобных и эпителиальных клеток.

К числу хромосомных заболеваний относятся: синдром Клайнфельтера, синдром Тернера-Шерешевского, синдром Дауна, синдром Патау, синдром Эдвардса и другие.

Больные с синдромом Клайнфельтера (47, ХХY) всегда мужчины. Они характеризуются недоразвитием половых желез, дегенерацией семенных канальцев, часто умственной отсталостью, высоким ростом (за счет непропорционально длинных ног).

Синдром Тернера-Шерешевского (45, Х0) наблюдается у женщин. Он проявляется в замедлении полового созревания, недоразвитии половых желез, аменорее (отсутствии менструаций), бесплодии. Женщины с синдромом Тернера-Шерешевского имеют малый рост, тело диспропорционально - более развита верхняя часть тела, плечи широкие, таз узкий - нижние конечности укорочены, шея короткая со складками, «монголоидный» разрез глаз и ряд других признаков.

Синдром Дауна - одна из самых часто встречающихся хромосомных болезней. Она развивается в результате трисомии по 21 хромосоме (47; 21, 21, 21). Болезнь легко диагностируется, так как имеет ряд характерных признаков: укороченные конечности, маленький череп, плоское, широкое переносье, узкие глазные щели с косым разрезом, наличие складки верхнего века, психическая отсталость. Часто наблюдаются и нарушения строения внутренних органов.

Хромосомные болезни возникают и в результате изменения самих хромосом. Так, делеция р-плеча аутосомы №5 приводит к развитию синдрома «крик кошки». У детей с этим синдромом нарушается строение гортани, и они в раннем детстве имеют своеобразный «мяукающий» тембр голоса. Кроме того, наблюдается отсталость психомоторного развития и слабоумие.

Чаще всего хромосомные болезни являются результатом мутаций, произошедших в половых клетках одного из родителей.

Биохимический метод

Позволяет обнаружить нарушения в обмене веществ, вызванные изменением генов и, как следствие, изменением активности различных ферментов. Наследственные болезни обмена веществ подразделяются на болезни углеводного обмена (сахарный диабет), обмена аминокислот, липидов, минералов и др.

Фенилкетонурия относится к болезням аминокислотного обмена. Блокируется превращение незаменимой аминокислоты фенилаланин в тирозин, при этом фенилаланин превращается в фенилпировиноградную кислоту, которая выводится с мочой. Заболевание приводит к быстрому развитию слабоумия у детей. Ранняя диагностика и диета позволяют приостановить развитие заболевания.

42. Пренатальная диагностика врожденных и наследственных болезней - это комплексная отрасль медицины, которая быстро развивается. Она использует и ультразвуковую диагностику (УЗИ), и оперативную технику (хорионбиопсию, амнио-и кордоцентез, биопсию мышц и кожи плода), и лабораторные методы (цитогенетические, биохимические, молекулярно-генетические).

Пренатальная диагностика имеет исключительно важное значение при медико-генетическом консультировании, поскольку она позволяет перейти от вероятного к однозначному прогнозированию здоровья ребенка в семьях с генетическими осложнениями. В настоящее время пренатальная диагностика осуществляется в I и II триместрах беременности, то есть в периоды, когда в случае выявления патологии еще можно прервать беременность. На сегодня возможна диагностика практически всех хромосомных синдромов и около 100 наследственных болезней, биохимический дефект при которых установлен достоверно.

Пренатальная диагностика - комплексная дородовая диагностика с целью обнаружения патологии на стадии внутриутробного развития. Позволяет обнаружить более 98 % плодов с синдромом Дауна (трисомия 21); трисомии 18 (известной как синдром Эдвардса) около 99,9 %; трисомии 13 (синдром Патау) около 99.9%, более 40 % нарушений развития сердца и др. В случае наличия у плода болезни родители при помощи врача-консультанта тщательно взвешивают возможности современной медицины и свои собственные в плане реабилитации ребёнка. В результате семья принимает решение о судьбе данного ребёнка и решает вопрос о продолжении вынашивания или о прерывании беременности.

К пренатальной диагностике относится и определение отцовства на ранних сроках беременности, а также определение пола плода.

Показания для пренатальной диагностики : наличие в семье наследственного заболевания; возраст матери старше 37 лет; носительство матерью гена Х-сцепленного рецессивного заболевания; наличие в прошлом спонтанных абортов в ранние сроки беременности, мертворождений, детей с пороками развития, хромосомной патологией; наличие структурных перестроек хромосом у одного из родителей; гетерозиготность обоих родителей по одной паре аллелей при патологии с аутосомно-рецессивным типом наследования; зона повышенного радиационного фона.

В настоящее время применяются непрямые и прямые методы пренатальной диагностики. При непрямых методах обследуют беременную (акушерско-гинекологические методы, сыворотка крови на альфа-фетопротеин), при прямых - плод.

К прямым методам, которые проходят без нарушения тканей, без хирургического вмешательства относится ультрасонография. К прямым методом, которые проходят с с нарушением целостности тканей – хорионбиопсия, амниоцентез, кордоцентез и фетоскопия.

Ультрасонография, эхография – это использование ультразвука для получения изображения плода и его оболочек, состояния плаценты.

На 5-й неделе беременности уже можно получить изображение оболочек эмбриона, к концу 6-й недели можно зарегистрировать его сердечную деятельность, а на 7-й неделе можно получить изображение и самого будущего ребенка.

В первые два месяца беременности УЗИ еще не позволяет выявить аномалии развития плода, но может определить его жизнеспособность. На 12 - 20-й неделе беременности уже возможна диагностика близнецовой беременности, локализации плаценты, отсутствия головного или спинного мозга, дефектов костной системы, закрытия невральной трубки, заращение естественных каналов желудочно-кишечного тракта.

Метод безопасен, поэтому продолжительность исследования не ограничена, и его можно применять повторно. При нормальном течении беременности проводят двукратное УЗИ, а при беременности с риском осложнений оно проводится с интервалами в 2 недели.

УЗИ плода обязательно при: наличии у родителей и ближайших родственников врожденных пороков развития; экстрагенитальных заболеваниях у беременной, например, гипертонической болезни, сахарного диабета, тиреотоксикоза, порока сердца, ожирения и др.; наличии мертворожденных детей, перинатальной смерти двух и более детей; угрозе прерывания беременности, кровотечении; недостаточной прибавке массы тела беременной; несоответствии размеров матки сроку беременности; многоплодии; фибромиоме матки.

В целом УЗИ позволяет получить данные о размерах плода (длина туловища, бедра, плеча, диаметр головы), о наличии у него дисморфии, о работе сердца, об объеме жидкости в зародышевой оболочке и размерах плаценты.

УЗИ позволяет обнаружить у плода и некоторые пороки развития. Например, отсутствие головного и спинного мозга, чрезмерное количество спинномозговой жидкости в полости черепа, аномалии структуры почек, неправильное развитие конечностей, легких, множественные врожденные пороки, пороки сердца, отек плода и плаценты.

Эхографияплаценты позволяет установить ее расположение, наличие отслойки ее отдельных участков, кисты, признаки старения, истончение или утолщение плаценты.

Допплеровское ультразвуковое сканирование, цветная допплерометрия отражают кровообращение плода.

ЯМР-томография плода позволяет выявить структурные аномалии, не обнаруживаемые при УЗИ, например, малые аномалии мозга, туберозный склероз, аномалии структуры почек и др.

Часто используют три метода исследования: уровня альфа-фетопротеина (особый эмбриональный белок), содержания хорионического гонадотропина (гормон, вырабатываемый плацентой в период беременности) и свободного эстриола (женский половой гормон) в крови женщины во 2-м триместре беременности. Отклонения этих показателей от нормы служат индикаторами высокого риска для плода.

Содержание альфа-фетопротеина в биологических жидкостях повышено при множественных пороках развития плода, спинномозговой грыже, чрезмерном количестве спинномозговой жидкости в области черепа, отсутствии головного или спинного мозга, пороках развития желудочно-кишечного тракта, дефектах передней брюшной стенки, аномалиях почек, фетоплацентарной недостаточности (недостаточной работе плаценты), задержке развития плода, многоплодной беременности, преэклампсии, резус-конфликте, вирусном гепатите В.

Концентрация альфа-фетопротеина в крови беременной снижена в случаях хромосомных болезней у плода, например, болезни Дауна, или наличия у беременной сахарного диабета I типа.

В настоящее время исследование альфа-фетопротеина проводится в 1-м триместре беременности одновременно с определением специфического для беременных белка А, что позволяет диагностировать болезнь Дауна и некоторые другие хромосомные аномалии у плода уже на 11 - 13-й неделях.

Хорионический гонадотропин (ХГ) определяется уже на 8 - 9-й дни после зачатия. При исследовании крови женщины во 2-м триместре беременности повышение уровня ХГ свидетельствует о задержке внутриутробного развития плода, высоком риске его гибели, отслойке плаценты, и о других видах фетоплацентарной недостаточности (нарушение работы плаценты).

Исследование уровня белка беременности I (Schwangerschaft protein I) в плазме крови женщин уже в 1-м триместре беременности служит индикатором хромосомных болезней плода.

Хорионбиопсия – это взятие ткани хориона (зародышевая оболочка). Проводится между 8-й и 10-й неделями. Ткань используется для цитогенетических и биохимических исследований, анализа ДНК. С помощью этого метода можно выявлять все виды мутаций (генные, хромосомные и геномные).

Значительным преимуществом хорионбиопсии является то, что она может быть использована на ранних этапах развития плода. Т. е. если выявятся отклонения в развитии плода и родители решат прервать беременность, то аборт на 10 – 12 неделе менее опасен, чем на 18 - 20-й неделе, когда становятся известны результаты амниоцентеза.

Амниоцентез – получение амниотической жидкости (жидкость вокруг зародыша) и клеток плода для анализа. Получение материала возможно на 16-й неделе беременности.

Основные показания для амниоцентеза общие: возраст беременной более 35 лет;нарушения нормы уровней альфа-фетопротеина, хорионичеокого гонадотропина и свободного эстриола в крови беременной;наличие нескольких серьезных факторов риска осложнений беременности.

Отдельные: мертворождения, перинатальная смертность;рождение предыдущего ребенка с хромосомными болезнями или с дисморфическими признаками;хромосомный сбалансированный мозаицизм у родителей;синдром ломкой Х-хромосомы у ближайших родственников;определение пола плода при риске наследственных Х-сцепленных заболеваний (гемофилия, иммунодефицит и др.);наследственные болезни обмена веществ;воздействие тератогенных агентов на организм беременной в критические периоды развития плода;задержка внутриутробного развития и дисморфия плода по данным УЗИ;риск внутриутробных инфекций (краснуха, цитомегалия, токсоплазмоз).

Осложнения при этом методе исследования не превышают 1 %.

Амниотическая жидкость используется для биохимических исследований, которые выявляют генные мутации. А клетки используются для анализа ДНК (выявляет генные мутации), цитогенетического анализа и выявления Х- и Y-хроматина (диагностирует геномные и хромосомные мутации).

Биохимические исследования амниотической жидкости могут дать ценную информацию. Например, диагностика адреногенитального синдрома (нарушения синтеза гормонов корой надпочечников и работы системы гипаталамус - гипофиз – яичники) у эмбриона возможна уже на 8-й неделе.

Исследование спектра аминокислот амниотической жидкости позволяет выявить некоторые наследственные болезни обмена веществ у плода, например, аргинин-янтарную ацидурию, цитруллинурию и др.

Исследование амниотической жидкости применяется для выявления хромосомных отклонений от нормы, определения активности ферментов.

Кордоцентез – взятие крови из пуповины. Материал используется для цитогенетических, молекулярно-генетических и биохимических исследований. Проводится с 18-й по 22-ю неделю.

Преимущество кордоцентеза по сравнению с амниоцентезом заключается в том, что берется кровь плода, что имеет решающее значение для диагностики внутриутробных инфекций, например, ВИЧ, краснухи, цитомегалии, парвовируса В19.

Однако показания для проведения кордоцентеза ограничены в связи с высоким риском осложнений, таких как внутриутробная гибель плода (до 6 %), недонашивание беременности (9 %).

Фетоскопия - осмотр плода фиброоптическим эндоскопом, введенным в зародышевую оболочку через переднюю стенку матки. Метод позволяет осмотреть плод, пуповину, плаценту и произвести биопсию.

Фетоскопия имеет очень ограниченное применение, т. к. сопровождается высоким риском прерывания беременности и технически сложна.

Современные технологии позволяют осуществлять биопсию кожи, мышц, печени плода. Материал используется для диагностики тяжелых наследственных заболеваний, например, генодерматозов, мышечных дистрофий, гликогенозов и др.

Риск прерывания беременности при применении методов пренатальной диагностики, нарушающих целостность тканей, составляет 1 - 2%.

Везикоцентез – прокол стенки мочевого пузыря плода для получения его мочи. Материал используется для исследования в случаях серьезных заболеваний и пороков развития органов мочевой системы.

Доимплантационная диагностика наследственных болезней стала возможной благодаря появлению экстракорпорального оплодотворения и использованию множественных копий эмбриональной ДНК.

Существует технология для выявления таких болезней, как Тея-Сакса, гемофилия, миодистрофия Дюшенна, фрагильная Х-хромосома и др. Однако она доступна немногим очень крупным центрам и дорого стоит.

Разрабатываются методы выделения клеток плода, циркулирующих в крови беременной, для проведения цитогенетических, молекулярно-генетических и иммунологических анализов.

Развитие и распространение методов пренатальной диагностики наследственных заболеваний позволят значительно снизить частоту наследственной патологии новорожденных.